Strutturistica chimica

strutturistica chimica Settore della chimica che studia la distribuzione spaziale degli atomi, ioni e gruppi di una molecola, le relazioni che questa disposizione ha con le proprietà molecolari chimico-fisiche, specialmente con le proprietà di reazione chimica, e varie altre questioni connesse.

Caratteri generali

La s. è intesa in modo specifico alla valutazione dei parametri che descrivono la struttura molecolare (le distanze internucleari, gli angoli di legame, gli angoli diedri ecc). Queste grandezze geometriche sono correlabili, nella descrizione quantomeccanica di una molecola, alla distribuzione degli elettroni che circondano i nuclei determinandone le posizioni di equilibrio. Per questo motivo, una parte considerevole della s. riguarda lo studio delle funzioni d’onda elettroniche, che sono anche responsabili di altre proprietà strutturali, come il momento di dipolo, il momento magnetico ecc.

La s. fa uso delle proprietà di simmetria eventualmente presenti nella molecola, che vengono descritte dalla teoria dei gruppi, fornendo un’interpretazione teorica di fenomeni quali l’attività ottica, la stereoisometria ecc. Nata come scienza prettamente chimica anche dal punto di vista della natura dei mezzi di ricerca, la s. è con il tempo divenuta una materia interdisciplinare che coinvolge sia la chimica e la fisica (come principi e come strumenti d’indagine) sia la matematica, per le tecniche di calcolo richieste.

Gli studi delle relazioni fra struttura di una molecola e proprietà chimico-fisiche di questa hanno acquistato notevole importanza in molti settori d’interesse applicativo (biochimica, farmacologia, enzimologia, catalisi) per l’interpretazione che attraverso tali studi può essere fornita della reattività e delle interazioni con l’organismo umano (medicina, tossicologia) di vari composti chimici. La s. riveste inoltre grande importanza nella scienza dei materiali, per le strette correlazioni esistenti fra struttura chimica e proprietà tecnologiche dei materiali; basti citare l’influenza dei difetti reticolari sulle proprietà dei semiconduttori e le relazioni fra la struttura della superficie di ossidi, di metalli ecc. e le loro proprietà catalitiche.

A partire dagli ultimi decenni del 20° sec. la s. ha avuto un notevole sviluppo, dovuto sia all’impiego di nuove metodologie sperimentali sia all’utilizzo di tecnologie informatiche avanzate per la raccolta e l’analisi dei dati. Tale sviluppo ha permesso, da una parte, di affrontare l’analisi strutturale di sistemi molecolari complessi e dall’altra di ottenere informazioni più accurate sulla costituzione, configurazione e conformazione di molecole semplici. In particolare, si è registrato un interesse crescente per l’analisi strutturale di macromolecole biologiche (proteine, biopolimeri, acidi nucleici, enzimi). La conoscenza strutturale degli enzimi, in particolare delle regioni molecolari deputate alla catalisi, ha permesso di studiare in maggior dettaglio i meccanismi di molte reazioni metaboliche. Inoltre, è divenuto possibile, sulla base delle conoscenze strutturali, indirizzare la sintesi chimica verso composti capaci di interagire in maniera mirata con gli enzimi e di regolarne l’attività. La biologia strutturale è divenuta, fin dalla fine degli anni 1970, una delle più importanti aree di ricerca, anche per le sue notevoli applicazioni in campo farmaceutico e biotecnologico.

Tecniche e metodi

Diffrazione di raggi X. La tecnica più largamente utilizzata per lo studio della struttura delle molecole rimane quella basata sulla diffrazione di raggi X da parte di reticoli cristallini. Il problema principale nella determinazione della struttura tridimensionale delle proteine, e più in generale delle macromolecole di interesse biologico, è quello di ottenere cristalli che siano in grado di diffrangere i raggi X con l’efficienza necessaria per un’indagine accurata. L’accrescimento di cristalli è spesso difficile, poiché le proteine sono aggregati molecolari molto grandi, di forma sferica o globulare, con superfici irregolari, impossibili da impacchettare in un cristallo senza che si formino ampie cavità contenenti molecole di solvente disposte in modo disordinato (in media un cristallo proteico possiede un contenuto di solvente intorno al 50-60% in peso). In passato, si è cercato di sviluppare metodi di cristallizzazione che permettessero di ottenere cristalli di grandi dimensioni, in grado di dare origine a una figura di diffrazione di sufficiente intensità. Tuttavia, le macromolecole di maggior interesse sono sistemi complessi che producono cristalli estremamente piccoli (dimensione lineare di 5-10 μm). Questo problema è stato superato a partire dalla fine degli anni 1980 con l’impiego di sorgenti di raggi X di elevata intensità, quali i generatori di luce di sincrotrone, che forniscono fasci di radiazioni aventi intensità di 6-8 ordini di grandezza superiore rispetto a quella delle sorgenti convenzionali. L’impiego di sorgenti a elevata intensità ha permesso di effettuare determinazioni strutturali utilizzando cristalli molto piccoli (dell’ordine del micrometro) e di raggiungere un livello di risoluzione atomica anche nella determinazione della struttura delle proteine. Inoltre, è divenuto possibile studiare sistemi complessi a elevato peso molecolare (superiore a 106), quali, per es., i virus.

Notevoli progressi si sono registrati nel trattamento e nell’interpretazione dei dati di diffrazione che si ottengono da cristalli di molecole complesse. In particolare, sono stati messi a punto nuovi metodi (sia sperimentali sia di calcolo) per la risoluzione del cosiddetto problema della fase, insito nel metodo della diffrazione dei raggi X e dovuto al fatto che sperimentalmente risulta accessibile solo l’intensità e non la fase del raggio diffratto.

Lo sviluppo di tecniche di rivelazione (image plate) e di sistemi grafici computerizzati per la costruzione e correzione dei modelli strutturali ottenuti consente, con l’aiuto di software appositamente creati, di visualizzare frammenti successivi delle figure di diffrazione e costruire al loro interno lo scheletro della molecola. A tal fine si può sfruttare una serie di funzioni geometriche con cui si ruotano frammenti di molecola attorno ai legami, mantenendo la corretta stereochimica, o si muovono singoli atomi o interi gruppi di atomi rispetto a un sistema di riferimento. Inoltre, è possibile calcolare direttamente, sul modello di prova, distanze e angoli di legami e correggere la stereochimica di gruppi di amminoacidi. Con l’avvento di elaboratori sempre più potenti, i tempi di elaborazione sono divenuti estremamente brevi e con i sistemi avanzati di grafica si possono generare immagini stereoscopiche della struttura in esame che producono una visione tridimensionale della molecola. È possibile anche ruotare l’intera struttura o ingrandire singole parti, fornendo un’immagine immediata sia della struttura terziaria sia dei dettagli molecolari come, per es., il sito attivo delle proteine.

Alla crescente disponibilità di radiazioni X a lunghezza d’onda modulabile (in particolare, la radiazione di sincrotrone) è connesso lo sviluppo del metodo della diffusione anomala per la determinazione delle fasi, che sfrutta la dipendenza dalla lunghezza d’onda della radiazione incidente del fattore di struttura di atomi pesanti presenti nella proteina (per es., il ferro nell’emoglobina), o appositamente inseriti in essa.

L’avvento degli anelli di accumulazione della terza generazione ha consentito l’evoluzione della cristallografia risolta in tempo, tramite la quale, utilizzando radiazione policromatica, è possibile raccogliere i fotoni necessari alla risoluzione della struttura in tempi dell’ordine del nanosecondo, permettendo lo studio di fenomeni di interazione in vivo. Utilizzando tale tecnica si è studiato, per es., il meccanismo di rilascio del monossido di carbonio da cristalli di mioglobina e, in particolare, i cambiamenti strutturali della proteina che avvengono in tempi variabili dai nanosecondi ai millisecondi.

Altre metodiche strutturali. Parallelamente all’avanzamento delle tecniche basate sulla diffrazione dei raggi X, notevole sviluppo hanno anche avuto altre metodiche strutturali, tra le quali grande interesse rivestono quelle che, al contrario della diffrazione convenzionale dei raggi X, permettono di studiare le molecole o le macromolecole anche in soluzione. Tale studio è particolarmente importante per le molecole di interesse biologico, che svolgono la loro azione naturale in soluzione e per le quali l’impacchettamento allo stato solido potrebbe portare a un condizionamento significativo della stereochimica. Nessuna tecnica sperimentale permette di effettuare un’indagine strutturale completa dei sistemi complessi allo stato liquido, ma molte interessanti proprietà possono essere studiate senza la conoscenza completa della loro struttura tridimensionale.

Nell’analisi strutturale dei sistemi molecolari complessi in soluzione vengono adottati differenti approcci. Nel primo si utilizzano tecniche sperimentali che forniscono informazioni sulle dimensioni e sulla forma degli aggregati molecolari, trascurando ogni dettaglio a livello atomico. Tra queste vi sono le tecniche idrodinamiche (misurazioni di diffusione, di viscosità, di velocità di sedimentazione) e alcune tecniche di diffrazione in soluzione (diffrazione dei raggi X a basso angolo, diffusione quasi elastica della luce, microscopia elettronica, diffrazione di neutroni). Alternativamente, vi sono tecniche in grado di fornire informazioni solo su una piccola porzione del sistema in esame, con precisione a volte superiore a quella della diffrattometria a raggi X, ma sacrificando completamente una visione di insieme della struttura. Di solito queste tecniche di indagine – fluorescenza, EXAFS (extended X-ray absorption fine structure), EPR e, per alcuni aspetti, risonanza magnetica nucleare – si avvalgono di sonde inserite od opportunamente introdotte nel sistema in esame, dotate di proprietà particolari rispetto al resto del sistema. In linea di principio, utilizzando numerose sonde, è possibile investigare e ricostruire la maggior parte del sistema molecolare in esame. In pratica, si è soliti selezionare e studiare solo regioni ristrette e di particolare interesse del sistema. Infine, esistono tecniche sperimentali in grado di esaminare alcuni aspetti generali della struttura, trascurandone altri. In molti casi l’analisi strutturale parallela, eseguita con diversi approcci, permette di ottenere informazioni sufficienti a fornire un quadro accurato della struttura studiata.

Tecniche di ultima generazione. Tra le tecniche di più recente sviluppo, sta assumendo crescente importanza nello studio di macromolecole di interesse biologico quella del dicroismo circolare, basata sul fatto che le molecole otticamente attive assorbono in modo differente la luce polarizzata circolarmente in senso orario o antiorario. Così, gli spettri dicroici di α-eliche, foglietti β e random coil (➔ proteine) sono molto diversi tra loro. Ciò permette di determinare la quantità di ognuno di questi tipi di struttura secondaria presenti in una proteina.

Alcune tecniche di diffrazione (diffrazione di raggi X a basso angolo, diffusione della luce, diffrazione di neutroni) sono utilizzabili anche per lo studio di campioni che non presentano una struttura cristallina. Nel trattamento dei dati di diffrattometria ottenuti da molecole in soluzione si tiene conto del fatto che, durante il tempo di misura, le molecole sono soggette a moti rotazionali e traslazionali e, di conseguenza, il segnale sperimentale è una media che considera tutte le possibili orientazioni. Questo implica l’impossibilità di risalire direttamente alla struttura molecolare dettagliata dalla distribuzione dell’intensità diffratta, ottenuta come funzione dell’angolo compreso tra la direzione del raggio incidente e quella del raggio diffuso. Se si effettuano misurazioni dell’intensità diffusa per valori di tale angolo vicini allo zero (basso angolo) è possibile valutare il peso molecolare delle molecole presenti in soluzione. La dipendenza angolare dell’intensità diffratta per valori dell’angolo vicini allo zero permette di calcolare il raggio di girazione del campione. Se invece si considera un intervallo di angoli più ampio è possibile avere informazioni sulla forma degli aggregati molecolari. In particolare, si parte da alcuni modelli, come sfere, ellissoidi di rotazione, cilindri, e si verifica la loro validità calcolando il valore aspettato della diffrazione e confrontando i risultati calcolati con i dati sperimentali.

La tecnica di diffrazione neutronica, largamente utilizzata per ottenere informazioni strutturali sui sistemi molecolari, in passato è stata limitata dal fatto che, essendo debole l’interazione dei neutroni con la materia, è necessario avere a disposizione sorgenti ad alto flusso. Questo problema è stato in parte superato con la costruzione di reattori nucleari accessibili per studi strutturali. Una caratteristica peculiare della diffusione di neutroni, oltre a quella di permettere la localizzazione degli atomi leggeri, è la possibilità di effettuare sostituzioni isotopiche idrogeno-deuterio in parti specifiche della molecola in esame, in modo da poter studiare zone più ristrette del sistema.

La diffrazione elettronica ha permesso di determinare, con grande accuratezza, le distanze e gli angoli di legame di una grande varietà di molecole, grazie anche ai notevoli progressi sperimentali realizzati nella produzione e nel mantenimento dell’alto vuoto e nel controllo della velocità, della monocromaticità, delle dimensioni e della collimazione del fascio di elettroni. La tecnica della diffrazione elettronica applicata alle superfici, spesso indicata con la sigla LEED (low energy electron diffraction), è stata utilizzata nello studio dei siti attivi delle superfici adsorbenti, di processi di emissione elettronica e ioni, di processi di catalisi e di superconduttori.

L’impiego della radiazione di sincrotrone ha favorito, a partire soprattutto dalla metà degli anni 1980, lo sviluppo di nuovi tipi di spettroscopia a raggi X; tra questi l’EXAFS si è dimostrata molto utile per l’analisi strutturale di sistemi sia allo stato solido sia in soluzione. Dall’analisi di uno spettro EXAFS è possibile ottenere informazioni sul numero, sul tipo e sulla distanza degli atomi che circondano l’atomo che assorbe la radiazione X (fotoassorbitore). Le informazioni strutturali che si ottengono sono estremamente accurate (accuratezza dell’ordine di 10-1 pm), ma solo a breve distanza (0,5-0,8 nm) dal fotoassorbitore. La tecnica EXAFS è stata applicata con successo allo studio della struttura del sito attivo intorno agli atomi di metallo nelle metalloproteine con una precisione non ottenibile usando la diffrazione dei raggi X. Tale tecnica è stata anche utilizzata per lo studio di superconduttori, superfici e sistemi in soluzione.